Новая методика инженеров Массачусетского технологического института анализирует трехмерную организацию генома с разрешением в 100 раз выше, чем раньше.
Исследователи из Массачусетского технологического института создали метод под названием Region Capture Micro-C (RCMC), который отображает трехмерную структуру генома человека с разрешением в 100 раз выше при минимальных затратах, выявляя ранее невиданные взаимодействия генов и предлагая новое понимание генетических заболеваний.
Большая часть генома человека состоит из регуляторных областей, которые контролируют, какие гены экспрессируются в данный момент времени внутри клетки. Эти регуляторные элементы могут быть расположены рядом с геном-мишенью или на расстоянии до 2 миллионов пар оснований от мишени.
Чтобы обеспечить эти взаимодействия, геном зацикливается в трехмерной структуре, которая сближает удаленные области. Используя новую технику, исследователи Массачусетского технологического института показали, что они могут отображать эти взаимодействия с разрешением в 100 раз выше, чем это было возможно ранее.
«Используя этот метод, мы создаем карты трехмерного генома с самым высоким разрешением, которые когда-либо создавались, и мы видим множество взаимодействий между энхансерами и промоторами, которых раньше не наблюдалось», — говорит Андерс Сейр Хансен, исследователь. Доцент кафедры биологической инженерии Массачусетского технологического института и старший автор исследования Андервуд-Прескотт. «Мы рады возможности раскрыть новый слой трехмерной структуры с нашим высоким разрешением».
Выводы исследователей показывают, что многие гены взаимодействуют с десятками различных регуляторных элементов, хотя необходимы дальнейшие исследования, чтобы определить, какие из этих взаимодействий наиболее важны для регуляции данного гена.
«Теперь исследователи могут по доступной цене изучать взаимодействие между генами и их регуляторами, открывая мир возможностей не только для нас, но и для десятков лабораторий, которые уже проявили интерес к нашему методу», — говорит Вираат Гоэл, аспирант Массачусетского технологического института и один из ведущие авторы статьи. «Мы рады предоставить исследовательскому сообществу инструмент, который поможет им разобраться в механизмах, управляющих регуляцией генов».
Постдоктор Массачусетского технологического института Майлз Хусейн также является ведущим автором статьи, опубликованной сегодня (8 мая 2023 г.) в журнале Nature Genetics.
Картографирование с высоким разрешением
По оценкам ученых, более половины генома состоит из регуляторных элементов, контролирующих гены, которые составляют лишь около 2 процентов генома. Полногеномные ассоциативные исследования, которые связывают генетические варианты с конкретными заболеваниями, выявили множество вариантов, которые появляются в этих регуляторных регионах. Определение того, с какими генами взаимодействуют эти регуляторные элементы, может помочь исследователям понять, как возникают эти заболевания и, возможно, как их лечить.
Обнаружение этих взаимодействий требует картирования того, какие части генома взаимодействуют друг с другом, когда хромосомы упакованы в ядро. Хромосомы организованы в структурные единицы, называемые нуклеосомами, — нити ДНК, плотно обвитые вокруг белков, — помогающие хромосомам вписаться в небольшие пределы ядра.
Более десяти лет назад группа, в которую входили исследователи из Массачусетского технологического института, разработала метод под названием Hi-C, который показал, что геном организован как «фрактальная глобула», что позволяет клетке плотно упаковывать свою ДНК, избегая при этом узлов. Эта архитектура также позволяет ДНК легко разворачиваться и восстанавливаться, когда это необходимо.
Чтобы выполнить Hi-C, исследователи используют рестрикционные ферменты, чтобы разрезать геном на множество мелких частей и биохимически связать части, которые находятся рядом друг с другом в трехмерном пространстве внутри ядра клетки. Затем они определяют идентичность взаимодействующих частей, усиливая и упорядочивая их.
Хотя Hi-C многое говорит об общей трехмерной организации генома, его разрешение ограничено для выявления конкретных взаимодействий между генами и регуляторными элементами, такими как энхансеры. Энхансеры — это короткие последовательности ДНК, которые могут помочь активировать транскрипцию гена путем связывания с промотором гена — местом, где начинается транскрипция.
Чтобы достичь разрешения, необходимого для обнаружения этих взаимодействий, команда Массачусетского технологического института использовала новейшую технологию под названием Micro-C, которая была изобретена исследователями из Медицинской школы Массачусетского университета под руководством Стэнли Хси и Оливера Рандо. Micro-C был впервые применен к почкующимся дрожжам в 2015 году, а затем применен к клеткам млекопитающих в трех статьях в 2019 и 2020 годах исследователями, включая Хансена, Се, Рандо и других, из Калифорнийского университета в Беркли и Медицинской школы Массачусетса.
Micro-C обеспечивает более высокое разрешение, чем Hi-C, за счет использования фермента, известного как микрококковая нуклеаза, для расщепления генома. Рестриктазы Hi-C разрезают геном только в определенных последовательностях ДНК, которые распределены случайным образом, что приводит к фрагментам ДНК различных и больших размеров. Напротив, микрококковая нуклеаза равномерно разрезает геном на фрагменты размером с нуклеосому, каждый из которых содержит от 150 до 200 пар оснований ДНК. Эта однородность мелких фрагментов обеспечивает превосходное разрешение Micro-C по сравнению с Hi-C.
Однако, поскольку Micro-C исследует весь геном, этот подход по-прежнему не обеспечивает достаточно высокого разрешения, чтобы идентифицировать типы взаимодействий, которые хотели увидеть исследователи. Например, если вы хотите посмотреть, как 100 различных участков генома взаимодействуют друг с другом, вам нужно секвенировать не менее 100, умноженных на 100 раз, или 10 000. Геном человека очень велик и содержит около 22 миллионов участков с разрешением нуклеосом. Следовательно, для картирования Micro-C всего генома человека потребуется не менее 22 миллионов, умноженных на 22 миллиона чтений секвенирования, что обойдется более чем в 1 миллиард долларов.
Чтобы снизить эту стоимость, команда разработала способ более целенаправленного секвенирования взаимодействий генома, что позволило им сосредоточиться на сегментах генома, содержащих интересующие гены. Сосредоточив внимание на областях, охватывающих несколько миллионов пар оснований, количество возможных геномных сайтов уменьшается в тысячу раз, а затраты на секвенирование уменьшаются в миллион раз, примерно до 1000 долларов. Таким образом, новый метод, получивший название Region Capture Micro-C (RCMC), позволяет с минимальными затратами генерировать карты, в 100 раз более содержательные, чем другие опубликованные методы, за небольшую часть стоимости.
«Теперь у нас есть метод получения трехмерных карт структуры генома сверхвысокого разрешения очень доступным способом. Раньше это было так недоступно с финансовой точки зрения, потому что для получения высокого разрешения требовались миллионы, если не миллиарды долларов», — говорит Хансен. «Единственное ограничение заключается в том, что вы не можете получить весь геном, поэтому вам нужно примерно знать, какой регион вас интересует, но вы можете получить очень высокое разрешение по очень доступной цене».
Много взаимодействий
В этом исследовании исследователи сосредоточились на пяти областях размером от сотен тысяч до примерно 2 миллионов пар оснований, которые они выбрали из-за интересных особенностей, обнаруженных в предыдущих исследованиях. К ним относится хорошо охарактеризованный ген под названием Sox2, который играет ключевую роль в формировании тканей во время эмбрионального развития.
После захвата и секвенирования интересующих сегментов ДНК исследователи обнаружили множество энхансеров, которые взаимодействуют с Sox2, а также взаимодействия между соседними генами и энхансерами, которые ранее были невидимы. В других регионах, особенно в тех, которые полны генов и энхансеров, некоторые гены взаимодействовали с 50 другими сегментами ДНК, и в среднем каждый взаимодействующий сайт контактировал примерно с 25 другими.
«Люди видели несколько взаимодействий одного бита ДНК и раньше, но обычно порядка двух или трех, поэтому наблюдение такого количества взаимодействий было весьма значительным с точки зрения различий», — говорит Хусейн.
Однако метод исследователей не показывает, происходят ли все эти взаимодействия одновременно или в разное время, или какие из этих взаимодействий являются наиболее важными.
Исследователи также обнаружили, что ДНК, по-видимому, скручивается во вложенные «микрокомпартменты», которые облегчают эти взаимодействия, но они не смогли определить, как формируются микрокомпартменты. Исследователи надеются, что дальнейшее изучение лежащих в основе механизмов может пролить свет на фундаментальный вопрос о том, как регулируются гены.
«Несмотря на то, что в настоящее время мы не знаем, что может быть причиной этих микрокомпартментов, и у нас есть все эти открытые вопросы перед нами, у нас, по крайней мере, есть инструмент, чтобы действительно строго задать эти вопросы», — говорит Гоэл.
В дополнение к решению этих вопросов команда Массачусетского технологического института также планирует работать с исследователями из Бостонской детской больницы, чтобы применить этот тип анализа к геномным областям, которые были связаны с заболеваниями крови в полногеномных ассоциативных исследованиях. Они также сотрудничают с исследователями Гарвардской медицинской школы для изучения вариантов, связанных с нарушениями обмена веществ.
No comments:
Post a Comment