В многоклеточных организмах различают три типа гликозилирования белков. N-гликозилирование, O-маннозилирование и C-маннозилирование. Все эти процессы происходят в эндоплазматическом ретикулуме, и во всех них ферменты присоединяют остатки сахара к определенным участкам вновь образующегося белка.
В то время как N- и O-гликозилирование хорошо изучены, третья форма, C-маннозилирование боковых цепей триптофана, долгое время оставалась загадкой для исследователей. Хотя ей подвержено 20% всех секреторных белков, а также мембранных белков, до недавнего времени было неясно, для чего это изменение, как распознаются специфические белковые последовательности и как вообще химически возможна связанная ферментативная реакция.
В рамках международного сотрудничества исследователи из ETH Zurich, Института медицинских исследований Уолтера и Элизы Холл (WEHI) в Австралии, Чикагского и Бернского университетов выяснили структуру и функцию ответственного фермента «триптофан C- маннозилтрансфераза (СМТ). Соответствующее исследование было опубликовано в последнем номере журнала Nature Chemical Biology.
CMT является членом ферментов гликозилтрансфераз категории C (GT-C), одного из трех надсемейств гликозилтрансфераз. Наиболее заметным членом является олигосахарилтрансфераза (OST), которая отвечает за N-гликозилирование.
Подобно OST, CMT также распознает высокоспецифичные последовательности в белках, с тем отличием, однако, что у млекопитающих одновременно встречаются четыре различных CMT, которые также распознают разные белковые последовательности.
Сахара помогают иммунорецепторам выйти на клеточную поверхность
Только в последние годы были разработаны необходимые инструменты, такие как специальные антитела и методы масс-спектрометрии, чтобы иметь возможность исследовать степень C-маннозилирования. Было показано, что этот процесс происходит почти исключительно там, где необходима межклеточная коммуникация, особенно в цитокиновых рецепторах иммунной системы и GPCR адгезии. Последние служат «сенсорными антеннами» для растущих нейронов, пробивающихся через мозг.
«Эта тема очень актуальна, особенно для нашего понимания межклеточной коммуникации иммунной системы, — объясняет Каспар Лохер, профессор структурной биологии Швейцарской высшей технической школы Цюриха. — Сигнальные молекулы, такие как цитокины, направляют иммунный ответ во время инфекции. Хотя эти и связанные с ними рецепторы интенсивно изучались в течение десятилетий, долгое время игнорировалось, что С-маннозилирование определяет, достигает ли цитокиновый рецептор поверхности клетки для выполнения своей функции».
«Благодаря нашему пониманию структуры задействованных ферментов у нас теперь есть почти полное понимание того, как С-маннозилирование попадает на эти рецепторы», — добавляет первый автор исследования Жоэль Блох, бывший старший научный сотрудник группы Лохера.
Индивидуальный молекулярный конструктор
Исследователям ETH удалось получить фермент CMT в чистом виде. С помощью химиков из WEHI (Австралия) и Университета Берна они создали индивидуальные молекулы, имитирующие последовательности белков и сахарных субстратов, специфичных для CMT. Это позволило им впервые протестировать специфические свойства фермента в пробирке.
Исследователи быстро поняли, что химия ферментов CMT должна быть новой и полностью отличаться от химии OST. «В таком случае мы можем выяснить механизм фермента только с помощью структурного исследования с высоким разрешением. Проблема, однако, заключалась в том, что СМТ не мог кристаллизоваться до сих пор и имел слишком маленькую массу для крио-ЭМ, потому что этот метод особенно трудно применить к белкам с молекулярной массой менее 100 кДа», — объясняет Лочер.
Антитело позволяет проводить электронную микроскопию с высоким разрешением
В конце концов, прорыв привел к прорыву: в сотрудничестве с исследователями из Чикагского университета ученые ETH создали синтетическое антитело, которое специфически связывается с CMT. Это антитело увеличило массу фермента настолько, что его структуру можно было выяснить с помощью крио-ЭМ. С помощью крио-ЭМ-структур группа во главе с Каспаром Лохером, наконец, смогла расшифровать, как разные варианты CMT распознают разные белковые последовательности.
Основываясь на этих выводах, исследователи теперь могут более точно предсказать, какие белки в организме человека несут модификацию. Исходя из этого, они надеются, что в ближайшем будущем смогут захватить «протеом C-маннозила».
Расшифровав механизм связывания пептидов CMT, исследователи также надеются добиться прогресса в производстве специфичных для CMT ингибиторов. Такие молекулы могут способствовать прогрессу в производстве лекарств, например, для борьбы с возбудителем малярии Plasmodium falciparum, который имеет свой собственный CMT и нуждается в нем для прикрепления к хозяину.
Также можно использовать последовательность и органную специфичность варианта CMT2 CMT человека, поскольку он играет ключевую роль в развитии сперматозоидов. Таким образом, новые результаты могут быть использованы для разработки ингибиторов CMT2 в качестве противозачаточных средств для мужчин.
Новый ферментный механизм
Еще одной загадкой для ученых было Ферментативный механизм СМТ. Это создает уникальную углерод-углеродную связь между белком и сахаром. Используя изготовленную на заказ молекулу ингибитора CMT, ученые смогли «захватить» CMT в середине реакции переноса гликозила и выяснить его крио-ЭМ-структуру.
Это позволило им визуализировать механизм реакции CMT: ранее неизвестную форму электрофильного ароматического замещения, обеспечиваемую точно расположенными боковыми цепями. Такое понимание может способствовать разработке дизайнерских ферментов, которые катализируют связи между атомами углерода.
Эволюционно законсервированный защитный механизм гликозилтрансфераз
Имея в общей сложности четыре различных структуры CMT, ученым впервые удалось визуализировать практически полный каталитический цикл фермента суперсемейства GT-C.
В процессе они открыли удивительный механизм: сахарные субстраты CMT сложны в производстве из-за их связывания с липидами и поэтому особенно ценны. Как оказалось, СМТ изначально связывает их в нереактивно защищенном связующем кармане. Только тогда, когда белок или пептид, который нужно модифицировать, стыкуется с CMT, сахарный субстрат смещается пептидным сенсором и приводится в высокореактивное состояние.
Ученые предполагают, что этот механизм эволюционно законсервирован в ферментах GT-C и предотвращает преждевременное потребление ценных молекул субстрата. «Обнаружив общую архитектуру ферментов GT-C три года назад, мы теперь имеем целостное представление об их ферментативной химии. Это еще одна веха в гликобиологии», — объясняет Лочер.
No comments:
Post a Comment